硒蛋白X基因克隆、定点突变、原核表达及多克隆抗体制备

编号 zgly0001495134

文献类型 期刊论文

文献题名 硒蛋白X基因克隆、定点突变、原核表达及多克隆抗体制备

作者 赵华  汤加勇  曹蕾  周继昌  贾刚  刘光芒  陈小玲  王康宁 

作者单位 四川农业大学动物营养研究所  深圳市慢性病防治中心分子生物学实验室 

母体文献 动物营养学报 

年卷期 2015年05期

年份 2015 

分类号 Q78 

关键词 猪Sel X基因  克隆  定点突变  原核表达  多克隆抗体 

文摘内容 本试验旨在克隆鉴定猪硒蛋白X(Sel X)基因,将其定点突变后进行原核表达,获得重组蛋白,并制备猪Sel X多克隆抗体,为以猪为模型Sel X功能研究奠定基础。利用c DNA末端快速克隆(3’-RACE)技术从猪肝脏总RNA扩增出含开放阅读框(ORF)至poly(A)共1 215 bp的Sel X基因c DNA片段,其348 bp的ORF编码区和对应的氨基酸残基与人相应序列分别有88%和91%序列同源性,猪Sel X基因提交NCBI Gen Bank数据库,序列号为EF113597。ORF编码氨基酸残基中硒代半胱氨酸(Sec)位于C-端第95个残基,其编码密码子TGA经定点突变为半胱氨酸(Cys)的TGT后,将其插入载体p ET30,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.5 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导2 h获得融合表达产物,经His-tag亲和层析后,获得分子质量为18.0 ku的纯化蛋白。将纯化获得的Sel X基因突变体融合蛋白(Sel Xm)免疫兔子,得到效价高达1∶20 000的多克隆抗体,免疫印迹(Western-blot)结果显示该抗体能特异性识别纯化的Sel Xm和猪肝脏中相应Sel X。本试验成功克隆并鉴定了猪Sel X基因,并制备了其多克隆抗体。