奶山羊LXRα基因shRNA序列的筛选及腺病毒载体的构建与鉴定

编号 zgly0001411770

文献类型 期刊论文

文献题名 奶山羊LXRα基因shRNA序列的筛选及腺病毒载体的构建与鉴定

作者 钟瑜  罗军  王维  胡仕良  李君  孙雨婷  郝娟  石恒波 

作者单位 西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室 

母体文献 西北农林科技大学学报(自然科学版 

年卷期 2011年11期

年份 2011 

分类号 S827  S852.65 

关键词 肝脏X受体α  RNA干扰  腺病毒载体  奶山羊 

文摘内容 【目的】构建针对奶山羊肝脏X受体α(Liver X receptorα,LXRα)基因的干扰腺病毒载体。【方法】根据奶山羊LXRα基因CDS区域设计小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),分别构建pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA及pDsRed1/C1-LXRα载体,共转染HEK 293细胞,48h后观察其荧光蛋白表达量,筛选出具有明显干扰效应的shRNA。将具有明显干扰效应的shRNA载体与腺病毒骨架载体pAd/PL-DEST在LR ClonaseTMⅡ重组酶的作用下进行重组,经氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选后获得重组腺病毒载体。将构建好的重组腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK 293细胞,培养7～10d后收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液,反复扩增3次后,获得高滴度的重组腺病毒,测定其病毒滴度。【结果】①设计出了shRNA-490、shRNA-496、shRNA-509和shRNA-923 4条shRNA序列;②得到shRNA-490和shRNA-923 2条具有明显干扰效应的shRNA;③获得pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-490和pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA-923 2个重组腺病毒载体,ScaⅠ酶切及测序结果均正确,2个腺病毒重组载体滴度均为5×108 PFU/mL。【结论】奶山羊LXRα基因重组shRNA腺病毒载体构建成功,为利用RNA干扰技术研究LXRα基因在乳腺上皮细胞中的功能奠定了基础。