苹果N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达

编号 zgly0001577814

文献类型 期刊论文

文献题名 苹果N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达

作者 吴成成  李保华  练森  梁文星  王彩霞 

作者单位 青岛农业大学植物医学学院山东省植物病虫害综合防控重点实验室 

母体文献 植物生理学报 

年卷期 2018年01期

年份 2018 

分类号 S661.1 

关键词 苹果  MpASMT1  克隆  生物信息学  原核表达 

文摘内容 以‘富士’和‘嘎啦’苹果（Malus pumila）叶片总RNA为模板,利用反转录PCR（RT-PCR）技术,克隆N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶（ASMT）基因,通过DNAMAN、MEGA 5.1、Prot Param等生物信息学软件对基因cDNA序列、系统进化关系、理化性质等进行分析,将克隆的苹果ASMT基因与表达载体pET32a连接,构建原核表达载体并转入大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株Rosetta（DE3）中,优化原核表达条件,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测融合蛋白的可溶性,用蛋白免疫印迹法（western blot）和酶活性测定验证目的蛋白的表达。结果表明,获得了苹果ASMT的全长cDNA序列,命名为MpASMT1（Gen Bank登记号MF135479）。该基因开放阅读框（ORF）为1 077 bp,编码358个氨基酸。MpASMT1编码蛋白的理论分子量约为39.7 kDa,等电点为5.42,是非分泌型、疏水的稳定蛋白;其263位组氨酸（His）为催化位点,225位谷氨酸为底物S-腺苷甲硫氨酸结合位点。多序列比对及系统发生树分析表明,MpASMT1编码的氨基酸序列与珠美海棠（M.zumi）MzASMT1（KJ123721）同源性最高,相似性达99.2%,其次为葡萄（Vitis vinifera）ASMT（LOC100248671）,氨基酸序列相似性为66.4%。原核表达结果显示,经0.252.0 mmol·L-1异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的重组质粒可特异性表达分子量约58 kDa的融合蛋白,且低温条件（15和25°C）能够提高该蛋白的可溶性表达;western blot分析表明融合表达蛋白能与His单克隆抗体特异性结合,纯化蛋白的酶活性为7.8 pmol·mg-1（蛋白）,进一步证实MpASMT1编码蛋白成功表达。