猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

编号 zgly0000823946

文献类型 期刊论文

文献题名 猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

作者 曹伟伟  郭抗抗  许信刚  宁蓬勃  刘伟  程敏  董玲娟  徐磊  高婉俊  任敏 

作者单位 西北农林科技大学动物科技学院 

母体文献 西北农林科技大学学报: 自然科学版 

年卷期 2013(1)

页码 13-18

年份 2013 

分类号 S852.651 

关键词 猪圆环病毒Ⅱ型  TaqMan荧光定量PCR  病毒检测 

文摘内容 【目的】:建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。[方法】:根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列, 在PCV2的ORF2核苷酸序列的保守区域, 设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物; 利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后, 回收PCR扩增产物, 连接pMD19-T载体, 转化DH5a大肠杆菌, 涂布Amp’琼脂平板, 挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒, 作为荧光定量PCR的标准品; 以标准品为模板建立检测PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR方法, 并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价; 用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测, 并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】:建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法, 其标准曲线的斜率为-3.383, R2=0.998, 具有良好的线性关系; 重复性试验结果表明, 该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%, 具有良好的稳定性; 敏感性检测结果表明, 该方法的最低检测限度为5.06copies/μL; 特异性检测结果显示, 该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性, 对PCV-2标准品的检测结果为阳性, 说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中, 所建立的Taq—Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】:成功建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法, 该方法可用于临床上对PCV2的检测。