猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

编号 zgly0001680037

文献类型 期刊论文

文献题名 猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立

作者 闫瑞杰  张云飞  刘玲玲  张红垒  王亚宾  胡慧 

作者单位 河南农业大学牧医工程学院 

母体文献 西北农林科技大学学报(自然科学版 

年卷期 2019年10期

年份 2019 

分类号 S852.651 

关键词 猪δ冠状病毒  N蛋白  原核表达  多克隆抗体  血清学检测 

文摘内容 【目的】制备猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21（DE3）,用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清（1∶80稀释）37℃孵育1 h,酶标二抗（1∶6 000稀释）37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD450值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。