甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx1原核表达、纯化及酶学性质分析

编号 zgly0001720231

文献类型 期刊论文

文献题名 甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx1原核表达、纯化及酶学性质分析

作者 杨付来  赵真真  王月华  张兰  张燕宁  毛连纲  蒋红云 

作者单位 中国农业科学院植物保护研究所 

母体文献 昆虫学报 

年卷期 2020年08期

年份 2020 

分类号 S433.4 

关键词 甜菜夜蛾  谷氧还蛋白  原核表达  融合蛋白  酶活力 

文摘内容 【目的】谷氧还蛋白（glutaredoxin, Grx）是生物体内依赖硫醇的抗氧化酶,在生物氧化胁迫和细胞凋亡等许多重要的生命活动中发挥作用。本研究旨在测定甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氧还蛋白家族成员SeGrx1的基因序列以及酶催化反应特性,为揭示其在昆虫体内功能奠定基础。【方法】以前期获得的甜菜夜蛾转录组数据为基础,采用RACE-PCR技术克隆甜菜夜蛾Grx1基因cDNA全长序列。将甜菜夜蛾Grx1基因的ORF序列连接至pET-16b原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中,IPTG诱导融合蛋白表达后用镍柱和Superdex75/200分子筛纯化;采用荧光酶标仪测定纯化的SeGrx1的活性及酶促反应动力学参数。【结果】甜菜夜蛾SeGrx1基因（GenBank登录号:MK318813） cDNA全长738 bp,其中5′非编码区长40 bp,3′非编码区长347 bp,开放阅读框（ORF）全长351 bp,编码116个氨基酸,预测蛋白的相对分子量为12.57 kD,活性位点为CPYC,为双巯基谷氧还蛋白。SeGrx1中心由4个平行和反向平行的β-strand混合组成,外围被5个α螺旋包围。成功构建pET-16b-SeGrx1重组质粒并在大肠杆菌中高表达,经过诱导和纯化条件的优化,获得纯度在95%以上的SeGrx1目的蛋白。以人类谷氧还蛋白hGrx1为标准,SeGrx1比活力为0.577 U/mg pro,最大反应速度Vmax为20.5 U/mg pro,米氏常数Km为14.3 nmol/L。【结论】本研究成功地在体外大量表达了甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx1,并且获得了它的酶促动力学参数,为进一步挖掘谷氧还蛋白的生物学功能,探索其在害虫防治中的应用提供了基础。