家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的CRISPR敲除载体的构建与导入

编号 zgly0001639133

文献类型 期刊论文

文献题名 家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的CRISPR敲除载体的构建与导入

作者 朱文恺  甘泉  贺伟  张新伟  周跃  吴梦雪  孙同同  江松  孟艳 

作者单位 安徽农业大学生命科学学院  安徽省蚕桑资源利用国际联合研发中心 

母体文献 应用昆虫学报 

年卷期 2018年02期

年份 2018 

分类号 Q78  S881.2 

关键词 CRISPR/Cas9  基因编辑  sgRNA  家蚕  β-呋喃果糖苷酶 

文摘内容 【目的】CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具,具有简便高效、特异性强等优势。BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase,β-FFase）的基因,也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因。β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶,BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关,但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰。为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能,本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体,用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因。【方法】根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA,通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的Sal I和Nhe I酶切位点。进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入G0代蚕卵,经催青孵化饲养家蚕并自交制备G1代蚕种。【结果】PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功。根据Ds Red2红色蛋白的荧光标记,从G1代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体。【结论】本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法,所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础,有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制。