绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析

编号 zgly0001548684

文献类型 期刊论文

文献题名 绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析

作者 卢海亭  乔军  孟庆玲  彭叶龙  陈诚  田路路  贡莎莎  才学鹏  陈创夫 

作者单位 石河子大学动物科技学院  阿克苏地区动物疫病控制诊断中心  中国农业科学院兰州兽医研究所 

母体文献 西北农林科技大学学报(自然科学版 

年卷期 2017年08期

年份 2017 

分类号 S852.4 

关键词 绵羊肺炎支原体  单核细胞增生李斯特菌  p74基因  同源重组 

文摘内容 【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5株感受态细胞,用氯霉素和高温双重压力筛选得到重组菌LM-Δrli60-ap74b。并通过SDS-PAGE及Western blot分析重组菌P74蛋白的表达情况,通过小鼠免疫试验检测其免疫原性。【结果】成功扩增出了rli60基因的上下游同源片段a、b及p74目的片段,采用SOEPCR方法获得融合片段ap74b,并成功亚克隆于穿梭质粒pKSV7中。对重组菌PCR鉴定结果表明,外源基因MO p74定点整合于LM基因组中。体外稳定性检验表明,p74基因能在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b可表达蛋白分子质量约为17ku重组蛋白;Western blot分析表明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b菌液可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性,重组菌能诱导机体产生1∶8~1∶16的抗体效价。【结论】获得了具有免疫原性的绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌。