斜纹夜蛾蜕皮响应基因E75D的克隆、原核表达分析及microRNA作用位点预测

编号 zgly0001433572

文献类型 期刊论文

文献题名 斜纹夜蛾蜕皮响应基因E75D的克隆、原核表达分析及microRNA作用位点预测

作者 高璐  左洪亮  姜春来  刘海远  钟国华 

作者单位 华南农业大学昆虫毒理研究室 

母体文献 昆虫学报 

年卷期 2012年05期

年份 2012 

分类号 Q963  S433.4 

关键词 斜纹夜蛾  E75D  克隆  原核表达  microRNA 

文摘内容 E75是昆虫蜕皮级联反应中的早期转录因子之一。本研究运用RT-PCR和RACE技术,首次获得了斜纹夜蛾Spodoptera lituraE75D基因,命名为Sli-E75D(GenBank登录号:JQ266225),其开放阅读框全长1836bp,编码611个氨基酸残基,3’非翻译区全长为358bp,同时获得其5’非翻译区共341bp。经核苷酸序列比对分析,E75在鳞翅目昆虫间保守性较高,尤其3’非翻译区具有高保守性,但由于启动子不同,E75异构体mRNA5’端序列存在差异;经氨基酸序列比对,Sli-E75D与棉贪夜蛾Spodoptera littoralis、烟草天蛾Manduca sexta、家蚕Bombyx mori E75D的一致性分别为98.4%,79.3%和76.5%。基于E753’非翻译区的高保守性,利用PITA和RNAhybird程序预测了最有可能调控鳞翅目昆虫E75基因的3种miRNAs:miR-14,miR-33和miR-87。构建pET28a-Sli-E75D表达载体,分别转化BL21(DE3)和Transetta(DE3)菌株,检测大肠杆菌Escherichia coli稀有密码子对E75D原核表达的影响,SDS-PAGE结果显示,转化Transetta(DE3)菌株的pET28a-Sli-E75D可高效表达大小约74.79kD(含预测的67.19kDSli-E75D,7.6kDT7·Tag和His·Tag)的重组蛋白,与其理论分子质量基本吻合,而转化BL21(DE3)菌株的pET28a-Sli-E75D质粒只见微量重组蛋白表达。由于Transetta(DE3)菌株可补充大肠杆菌6种稀有密码子的tRNA,较BL21(DE3)更适合于E75D的外源表达。qPCR检测了斜纹夜蛾从末龄幼虫到成虫发育过程中各时间点Sli-E75的相对表达水平:Sli-E75在6龄幼虫期的表达量较低,从预蛹开始,表达量急剧升高,并在蛹中期达到最高峰,之后迅速下降,但成虫期表达水平又出现回升。这些结果有助于深入研究E75在昆虫蜕皮级联反应中的作用。