绿盲蝽核受体基因AlE75D的克隆和性质分析

编号 zgly0001563516

文献类型 期刊论文

文献题名 绿盲蝽核受体基因AlE75D的克隆和性质分析

作者 谭永安  赵旭东  肖留斌  孙洋  赵静  柏立新  郝德君 

作者单位 南京林业大学南方现代林业协同创新中心  南京林业大学林学院  江苏省农业科学院植物保护研究所 

母体文献 昆虫学报 

年卷期 2017年09期

年份 2017 

分类号 S433.3 

关键词 绿盲蝽  AlE75D  基因克隆  表达谱  原核表达  单克隆抗体 

文摘内容 【目的】克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体。【方法】利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因Al E75D全长;qRTPCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用NdeⅠ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的p MD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性。【结果】从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因Al E75D(Gen Bank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 k D;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽Al E75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98%)。Al E75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,Al E75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到p Czn1载体上,IPTG可成功诱导p Czn1-Al E75D重组质粒特异性表达一个约75 k D的蛋白。用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗Al E75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及Al E75D重组蛋白特异性结合。【结论】Al E75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性。结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。