山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建

编号 zgly0001641678

文献类型 期刊论文

文献题名 山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建

作者 陶英杰  刘凤娟  毕春晓  任雪冰  曲瑞红  李科友  徐全乐 

作者单位 西北农林科技大学生命科学学院 

母体文献 西北农林科技大学学报(自然科学版 

年卷期 2018年08期

年份 2018 

分类号 S529 

关键词 山黧豆  CASase基因  基因克隆  载体构建  CRISPR/Cas9系统 

文摘内容 【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选低毒、高硫山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。