蜡梅AFLP-银染体系的建立与优化

编号 zgly0000535125

文献类型 期刊论文

文献题名 蜡梅AFLP-银染体系的建立与优化

学科分类 220.5010;园林植物学

作者 周明芹  杨琴军  陈龙清 

作者单位 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 

母体文献 华中农业大学学报 

年卷期 2007,26(3)

页码 394-398

年份 2007 

分类号 S685.170.36 

关键词 AFLP  蜡梅  PCR条件  反应体系  银染 

文摘内容       为了建立蜡梅AFLP-银染的优化体系,采用EcoRⅠ和MseⅠ 2种限制性内切酶酶切组合,对该2种酶的用量、酶切时间、预扩增与选择扩增中的Mg^2＋浓度、Taq DNA聚合酶的用量、引物的浓度以及预扩增产物的稀释倍数等因素进行了多水平的筛选,同时探讨了温度及聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的电流强度等因素对胶图的影响。结果表明：用5 U限制性内切酶酶切4 h便能在40μL的反应体系中完全切割500 ng的总DNA,酶切连接产物稀释10倍后在含有1.5 mmol/L Mg^2＋1、U Taq、预扩增引物E＋A和M＋C分别为40 ng的20μL反应体系中进行预扩增,将预扩增产物稀释30倍后在含有1.5 mmol/L Mg^2＋、0.6 U Taq、选择扩增引物E＋3为30 ng、M＋3为60 ng的20μL的体系中进行选择性扩增,能够得到质量比较好的AFLP胶图。此外,在进行PAGE电泳和硝酸银染色,将电泳的温度控制在50℃左右,电流控制在45～60 mA左右能提高胶图的质量。利用这种优化的反应体系,成功地评价了40个蜡梅基因型的遗传多样性,6对选择扩增引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性,它们分别是：E-AAC/M-CCC,E-ATC/M-CCC,E-AGA/M-CAG,E-AAA/M-CAC,E-ATA/M-CCA,E-ATT/M-CCA。