苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

编号 zgly0001528432

文献类型 期刊论文

文献题名 苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

作者 李莉莉  周晓群  赵奎军  雷蕾  樊东 

作者单位 东北农业大学农学院 

母体文献 应用昆虫学报 

年卷期 2016年04期

年份 2016 

分类号 S433.4 

关键词 苜蓿夜蛾  丝氨酸蛋白酶  克隆  原核表达  酶活性 

文摘内容 【目的】丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中,丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料,克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术,扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列,用大肠杆菌E.coli表达系统进行表达;再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为Hv SP,该基因已登录Gen Bank,登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,分子量约为30.8 ku,等电点为8.27,推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%~92%之间。在Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性最高,为28.7 U/m L。荧光定量PCR结果表明,Hv SP基因的m RNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达,且在中肠中表达量最高,但在唾腺中未检测到Hv SP的m RNA表达。【结论】该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性,为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。