苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

编号 zgly0001478125

文献类型 期刊论文

文献题名 苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

作者 周晓群  高艳玲  赵奎军  樊东 

作者单位 东北农业大学农学院 

母体文献 昆虫学报 

年卷期 2014年09期

年份 2014 

分类号 Q78 

关键词 苜蓿夜蛾  丝氨酸蛋白酶  cDNA克隆  原核表达  重组蛋白  酶活性 

文摘内容 【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP(GenBank登录号:JX866720),该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP(GenBank登录号:CAA72962)的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。