应用二温式PCR检测家蚕核型多角体病毒的方法

编号 zgly0001495801

文献类型 期刊论文

文献题名 应用二温式PCR检测家蚕核型多角体病毒的方法

作者 覃玥  陈保善 

作者单位 河池学院化学与生物工程学院  广西大学生命科学与技术学院  广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 

母体文献 蚕业科学 

年卷期 2015年03期

年份 2015 

分类号 S884.51 

关键词 家蚕核型多角体病毒  多角体蛋白基因  二温式PCR  反应条件 

文摘内容 为了简便、快速、准确地检测家蚕核型多角体病毒(Bm NPV),以Bm NPV广西分离株的多角体蛋白基因(polh)序列(Gen Bank登录号:JQ991011.1)设计引物,以感染Bm NPV(广西宜州分离株)2 h的5龄家蚕幼虫中肠组织提取的DNA为模板,建立二温式PCR检测Bm NPV的方法,最终确定的最佳反应体系为:10×PCR buffer 1.5μL,5 mmol/L Mg Cl22μL,2.5mmol/L d NTP 0.5μL,10μmol/L上、下游引物各1μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL,18 ng/μL模板DNA 1μL,加水至总体积15μL。确定的最佳反应条件为:94℃预变性3 min;95℃15 s,延伸和退火温度合并为62℃30 s,共25个循环。按上述条件PCR扩增得到大小约309 bp的特异性片段,测序结果与已知polh基因序列的相似度为100%。与普通PCR检测方法比较,采用二温式PCR方法对样本的检测时间节省1.5 h,反应特异性强,灵敏度高(能被检测的最小感病组织基因组DNA的质量浓度为1.8 pg/μL),并且选择最初2 h感病的幼虫中肠组织为检测材料,因而可用于家蚕血液型脓病的早期诊断。