人参SQE基因干扰载体的构建及转化

编号 zgly0000775062

文献类型 期刊论文

文献题名 人参SQE基因干扰载体的构建及转化

学科分类 220.45;经济林学

作者 于彦婷  任丽  孙春玉  蒋世翠  王义  张美萍 

作者单位 吉林农业大学生命科学学院细胞工程实验室 

母体文献 中国医药生物技术 

年卷期 2011,6(2)

页码 121-126

年份 2011 

分类号 R284.1 

关键词 人参  基因  药物载体  皂苷类 

文摘内容 目的探讨SQE基因对人参皂苷合成的影响。方法根据SQE基因保守区序列, 分别设计合成其正反义片段引物行RT-PCR扩增, 扩增产物分别与pMD18-T质粒连接后转化E.coliDH5a, 获得的pMD18-T-SQE—S、pMD18-T-SQE.A重组质粒经双酶切后, 将正反义片段与质粒pMHZll2反向连接, 转化E.coliDH5α, 构建SQE基因RNAi双元表达载体pMHZl12-SQE。电击法将鉴定正确的重组质粒pMHZl12-SQE转化农杆菌GV3101感受态细胞, 再利用农杆菌介导法转化人参愈伤组织, 提取抗性人参愈伤组织细胞基因组DNA, 进行PCR检测并计算抗性愈伤转化率; 同时提取人参皂苷, 采用HPLC方法检测抗性人参愈伤组织的皂苷含量。结果结果显示总RNA较完整无降解, 质量较好; RT-PCR扩增产物正反义片段大小与预期-致: 重组质粒pMD18-T-SQE—S、pMD18-T-SQE—A和pMHZI12-SQE分别经双酶切进行测序鉴定, 结果表明目的基因已插入霞组质粒且连接方向正确。人参愈伤组织细胞苯因组DNA的PCR检测结果显示1个菌落经2对引物扩增结果均呈阳性, 证明构建的pMHZl12-SQE重组质粒已成功整合入植物基因组中, 其抗性愈伤转化率为1%。转化pMHZll2-SQE重组质粒后, 人参抗性愈伤组织中单体皂苷Rgl、Re、Rc含量明显下降, Rb1略有升高, 实验组与对照组(转化空质粒)间Rg1、Re、Rb1、Rc的含量差异显著(均P〈0.05); 而2组均未检测出Rb2和Rd。结论成功构建了SQE基因RNAi双元表达载体, 通过转化人参愈伤组织抑制SQE基因的表达, 可以调控人参皂苷含量发生相应的改变。