家蚕微孢子虫海藻糖酶(Trehalase)基因的生物信息学分析及原核表达和多克隆抗体制备

编号 zgly0001528366

文献类型 期刊论文

文献题名 家蚕微孢子虫海藻糖酶(Trehalase)基因的生物信息学分析及原核表达和多克隆抗体制备

作者 李孝良  彭祥然  陈功  戴卫江  唐旭东  徐莉  沈中元 

作者单位 江苏科技大学生物技术学院  中国农业科学院蚕业研究所 

母体文献 蚕业科学 

年卷期 2016年06期

年份 2016 

分类号 S884 

关键词 家蚕微孢子虫  海藻糖酶  序列特征  基因克隆  原核表达  多克隆抗体 

文摘内容 海藻糖是家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)成熟孢子的主要糖类物质之一,海藻糖酶作为海藻糖代谢的主要催化酶,在微孢子虫的发芽及侵染过程中发挥重要作用。通过生物信息学分析发现,家蚕微孢子虫的海藻糖酶具有4个序列相似度较高的编码基因拷贝(Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4),除了Nb Tre4编码蛋白质的N端有18个氨基酸组成的信号肽,其他拷贝的编码蛋白质均没有信号肽结构域,但都具有少数的N-糖基化位点,而没有O-糖基化位点,此外,丝氨酸磷酸化位点的比率也较高,二级结构较为简单,仅有螺旋区和低复杂度区。基于生物信息学分析结果,设计特异性引物克隆了Nb Tre1基因,该基因片段长933 bp,编码310个氨基酸,预测蛋白质分子质量36.7 k D,蛋白质的氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点和14个磷酸化位点。通过构建重组表达载体并转化Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞,获得Nb Tre1蛋白的表达菌株,利用IPTG诱导获得大量以包涵体形式表达的融合Nb Tre1蛋白,其分子质量与预期值一致。融合Nb Tre1蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价达1∶25 600。通过Western blot检测验证了该多克隆抗体的特异性,制备的多克隆抗体能够应用于家蚕微孢子虫海藻糖酶的检测等。