梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立

编号 zgly0001713958

文献类型 期刊论文

文献题名 梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立

作者 袁英哲  韩剑  王岩  罗明  包慧芳  张春竹  黄伟 

作者单位 新疆农业大学农学院  新疆维吾尔自治区高校农林有害生物监测与安全防控重点实验室  新疆林业科学院现代林业研究所  新疆农业科学院微生物应用研究所  新疆巴州农业科学研究院 

母体文献 果树学报 

年卷期 2020年09期

年份 2020 

分类号 S432.42 

关键词 梨火疫病菌  叠氮溴化丙啶(PMA)  实时荧光定量PCR(qPCR)  活菌 

文摘内容 【目的】将叠氮溴化丙啶（PMA）与实时荧光定量PCR技术（qPCR）相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌（Erwinia amylovora）质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×108CFU·mL-1、PMA浓度为25μmol·L-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%～100%时(浓度为6.0×107～6.0×108CFU·mL-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系（R2=0.992 8）。灵敏度检测结果表明,6.0×103～6.0×108CFU·mL-1范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关（R2=0.994 7）,检测灵敏度下限为6×103CFU·mL-1（12 CFU/qPCR反应）。用建立的PMA-qPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符。【结论】本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的假阳性。