猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

编号 zgly0001712445

文献类型 期刊论文

文献题名 猪Cyclin A和CDK2蛋白对猪细小病毒增殖的调控作用

作者 唐青海  杨海  彭永刚  杨灿  何丽芳  王芳宇 

作者单位 衡阳师范学院生命科学与环境学院畜禽养殖生物工程技术研究所  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 

母体文献 西北农林科技大学学报(自然科学版 

年卷期 2020年08期

年份 2020 

分类号 S852.651 

关键词 猪CyclinA  猪CDK2  细胞周期  猪细小病毒  病毒增殖 

文摘内容 【目的】探究猪细胞周期素Cyclin A(pCyclinA)及其依赖性激酶2(pCDK2)对猪细小病毒(PPV)增殖的调控作用,为开展PPV复制机制研究提供依据。【方法】采用RT-PCR扩增pCyclinA和pCDK2基因,克隆至真核表达载体pEGFP-C1中构建重组载体,转染猪睾丸细胞(ST),经新霉素(G418)筛选获得pCyclinA或pCDK2过表达的ST细胞株。设计pCyclinA和pCDK2基因特异性干扰片段(shRNA)CycA894和CDK1163,构建干扰表达载体,转染ST细胞,经G418筛选得到pCyclinA和pCDK2低表达的ST细胞株,实时荧光定量PCR检测其干扰效率。流式细胞术分析pCyclinA和pCDK2过表达和低表达对ST细胞周期的影响。将猪细小病毒NY毒株(PPV-NY)接种过表达和低表达的ST细胞,用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测病毒滴度。【结果】pCyclinA和pCDK2基因的开放阅读框(ORF)分别为1 299和897 bp,构建了重组载体pEGFP-pCyclinA和pEGFP-pCDK2。荧光显微镜观察结果显示,融合蛋白EGFP-pCycA和EGFP-pCDK2分别在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中稳定表达。构建了干扰载体pGPU6-GFP/CycA894、pGPU6-GFP/CDK1163和pGPU6-GFP/-shNC(阴性对照);低表达细胞株ST-pGPU6-GFP/CycA894和ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的pCyclinA、pCDK2基因的mRNA表达量均极显著降低(P<0.01)。pCyclinA或CDK2过表达分别极显著或显著降低ST细胞S期的比例(P<0.01或P<0.05)。pCyclinA低表达能极显著降低ST细胞G0/G1期的比例(P<0.01)、极显著增加S期和G2/M期的细胞比例(P<0.01);pCDK2低表达能显著增加ST细胞G0/G1期的比例(P<0.05),但却显著降低S期的细胞比例(P<0.05)。PPV在过表达细胞株ST-pEGFP-pCyclinA和ST-pEGFP-pCDK2中的滴度均极显著低于对照细胞(P<0.01)。低表达细胞ST-pGPU6-GFP/CycA894中PPV滴度极显著增加(P<0.01),而ST-pGPU6-GFP/CDK1163中的PPV滴度无显著变化(P>0.05)。【结论】pCyclinA或pCDK2过表达均能抑制PPV增殖;pCyclinA低表达可促进PPV增殖,pCDK2低表达对PPV增殖无显著影响;pCyclinA低表达极显著降低G0/G1期细胞比例、但极显著增加S期和G2/M期细胞比例。