在烟草中酵母脯氨酸基因B的转化(英文)

编号 zgly0001578960

文献类型 期刊论文

文献题名 在烟草中酵母脯氨酸基因B的转化(英文)

作者 袁朝兴  白永延  匡达人 

作者单位 中国科学院上海植物生理研究所植物分子遗传国家重点实验室  中国科学院上海细胞生物研究所上海200032  上海200032  上海20003 

母体文献 植物生理学报 

年卷期 1993年03期

年份 1993 

关键词 根瘤农杆菌  脯氨酸基因B  烟草  耐盐性  转化 

文摘内容 重组质粒PYP22带有一从酵母基因文库分离到的4.6 kb DNA片段,此片段含有脯氨酸（Pro）合成途径必须的基因B（ProB）。用BamHⅠ酶解PYP22,回收ProB基因,重组入pGA471的Bg Ⅲ切口,形成含有ProB的双质粒载体PBYU4。pBYU4含有能在植物中表达的新霉素磷酸转移酶基因Ⅱ（NPT—Ⅱ）,可做转基因植株的筛选标记。借助于辅助质粒pRK2013,pBYU4经过三亲结合转移到农杆菌LAB4404,在含有四环素12.5μg/ml、链霉素100μg/ml和利福平50μ/ml加的AB培养基上筛选出转接合子。提取筛选得到的农杆菌总DNA,用ECoR 1酶解,1％琼脂糖电泳,Southern转移DNA到硝酸纤维素膜上。用α—32P-dCTP标记的ProB片段,与转移好的硝酸纤维素进行Southern杂交。Southern杂交证明含有ProB基因的农杆菌,在加有乙酸丁香酮（acetosyringone）125μg/ml和章鱼碱（octopine）125μg/ml的MS液体培养基中,诱导过夜。用叶圆片法转化革新1号烟草（Nicotana tabacum var.Gexin No.1）,叶片与菌液共培养2～5d。从叶片分化再生出的芽转移到含有卡那霉素（Km）80μg/ml、6—苄基腺嘌呤（6BA）1μg/ml和头孢氨噻腭钠（Cef）500μg/ml的MS培养基,筛选3周,将绿色的芽转移到含l％NaCl,6BA 1μg/ml和Cef 500μg/ml的MS培养基,进行复筛。测定经过这样筛选的再生芽的NPT—Ⅱ活性。