柞蚕NPV转移载体组建及外源基因在Sf9细胞、柞蚕卵巢原代细胞和蛹体中的表达

编号 zgly0001128200

文献类型 期刊论文

文献题名 柞蚕NPV转移载体组建及外源基因在Sf9细胞、柞蚕卵巢原代细胞和蛹体中的表达

作者 张春发  刘淑珊  范琦  王林美  李文利  李广泽 

作者单位 辽宁省农科院大连生物技术研究所  辽宁省农科院大连生物技术研究所 

母体文献 蚕业科学 

年卷期 1992年03期

年份 1992 

关键词 柞蚕  核型多角体病毒  转移载体  基因突变  载体表达系统 

文摘内容 根据对载有ApNPV核多角体蛋白基因的片段的酶谱和核苷酸序列分析结果,采用人工合成寡核苷酸引物引导的点突变方法,去掉了该基因的起始密码子（ATG突变为ATT）,经系列克隆组建了pApM740转移载体,其外源基因插入位点为nt+141（BamHI）。系用多聚酶链反应（Polymerase Chain Rea-ction简称PCR）技术,分别将nt+2～+140,nt+9～+140、和nt+37～+140切掉,组建了pApM740、741、748和736转移载体,其外源基因克隆位点分别为nt+1、+8和+36（均为BamHI切点）。将IL-4、DE基因分别克隆到pApM740、741、748和736载体中,并进行了转染表达实验:（1）将载有DE基因的上述四种载体质粒DNA分别与AcNPVWTDNA共转染Sf9细胞、经免疫抗体荧光检测,供试4个载体所载DE基因均得到表达;（2）将pApM741-IL4和pApM748-IL4重组载体质粒DNA分别与ApNPVWTDNA共转染柞蚕卵巢原代细胞,待多角体出现后,用PCR法检测病毒基因,证实IL-4基因已整合到ApNPV DNA基因组中;（3）将pApM748-DE重组载体质粒DNA与ApNPV WTDNA共转染柞蚕蛹获得成功。对病蛹病毒DNA进行PCR检测,证实DE基因已整合到病毒基因组中;取病蛹体液,用免疫沉淀及Western blotting方法检测DE蛋白,证实DE蛋白确已被表达。从而初步建立了柞蚕NPV载体—昆虫细胞宿主和柞蚕NPV载体—柞蚕蛹活