应用Gibson Assembly方法构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆

编号 zgly0001562136

文献类型 期刊论文

文献题名 应用Gibson Assembly方法构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆

作者 王伟  魏玉圆  翟少华  毛丽萍  皮文辉  简子健 

作者单位 新疆农业大学动物医学学院  新疆生产建设兵团绵羊遗传改良和健康养殖重点实验室 

母体文献 动物医学进展 

年卷期 2017年11期

年份 2017 

分类号 S852.655 

关键词 狂犬病病毒  Gibson Assembly连接法  构建  感染性cDNA克隆 

文摘内容 应用Gibson Assembly连接法精确快速构建狂犬病病毒SRV9株重组感染性cDNA克隆,为狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建提供新的方法。应用Gibson Assembly连接法在同一反应体系内,将多个片段和经限制性内切酶线性化的载体,按设计的顺序进行连接,实现多个片段的一步组装。设计带有20bp~30bp重叠序列的PCR引物,扩增得到带有重叠序列的狂犬病病毒5个结构蛋白基因和增强型荧光蛋白基因。扩增的片段和线性化的载体经胶回收纯化后,与Gibson连接液混合后,50℃反应60min,连接产物转化Stbl3感受态细胞,提取重组质粒,经PCR、酶切和测序鉴定,缺失了病毒伪基因Ψ区和糖蛋白基因的跨膜区并且将增强型荧光蛋白基因插入糖蛋白基因终止密码子前,构建了全长17 600bp的重组质粒,完成了重组全长感染性cDNA克隆的构建。