梨树组织中的苹果锈果类病毒原位RT-PCR检测

编号 zgly0000566084

文献类型 期刊论文

文献题名 梨树组织中的苹果锈果类病毒原位RT-PCR检测

作者 赵英  牛建新 

作者单位 石河子大学农学院园艺系  832003 

母体文献 分子植物育种 

年卷期 2008,6(4)

页码 812-818

年份 2008 

分类号 S661.2  Q783.1 

关键词 梨树  苹果锈果类病毒  cDNA探针  原位RT-PCR 

文摘内容 利用自行设计的方法分离提取总RNA,通过一对特异引物,分别扩增出不同梨树品种上苹果锈果类病毒(ASSVd)的特异片段,经由回收、克隆和测序,有10条序列已在GenBank(EU031467-EU031476)登录,利用克隆的ASSVd质粒,通过RT-PCR合成了生物素标记的cDNA探针,建立了斑点杂交检测技术。在此基础上以已知带有苹果锈果类病毒的库尔勒香梨和无类病毒梨树叶片为材料,利用DIG标记,研究了梨树类病毒的叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术。包括SuperScriptⅡ浓度、4种碱基混合物(dNTPs)、RNA酶抑制剂(RNasin)及互补引物浓度对cDNA合成的影响,退火温度、LA Taq DNA聚合酶、Mg^2＋、引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。研究结果表明：RNasin的用量大于0.2U/μL时,信号强度随着RNasin量的加大而增强;只有当dNTPs浓度达0.4mmol/L时才能生成一定量的cDNA;SuperScriptⅡ浓度在0.5～1.3U/μL均可进行正常的逆转录,而且在该范围内产物的量随SuperScriptⅡ浓度提高而增多;引物浓度达到0.9μmol/L以上时才能进行有效的逆转录,并且生成的cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ASSVd的cDNA适合退火温度为62℃。循环30～35次可出现较强的蓝色信号,引物浓度在0.8～1.2μmol/L时显色较好;LA Taq酶浓度为0.004U/μL以上,均显示较深的蓝色;Mg^2＋浓度为1.5mmol/L就可满足原位PCR所需。