猪CFTR基因特异性锌指核酸酶的筛选与鉴定

编号 zgly0000807321

文献类型 期刊论文

文献题名 猪CFTR基因特异性锌指核酸酶的筛选与鉴定

学科分类 220.1520;林木遗传学

作者 王瑞  王令  林娟  张存芳  张智英 

作者单位 西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室 

母体文献 西北农林科技大学学报: 自然科学版 

年卷期 2012(10)

页码 15-22

年份 2012 

分类号 Q812 

关键词 锌指核酸酶  囊性纤维化疾病  开源式方法  锌指蛋白  细菌双杂交 

文摘内容 【目的】:获得靶向猪囊性纤维化跨膜传导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因的特异锌指核酸酶(Zinc finger nuclease,ZFN), 为建立CFTR基因敲除猪细胞系提供技术支持。【方法】:通过开源式(Oligomerized pool engineering, OPEN)方法筛选, 首先以已知三锌指蛋白为框架, 随机突变单个锌指关键位点氨基酸编码序列, 建立人工三锌指蛋白随机库; 然后应用细菌双杂交技术, 从库中筛选出能够结合CFTR基因靶位点的三锌指蛋白; 最后将获得的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ组装成特异ZFN, 通过酵母验证体系, 检测ZFN靶向切割其识别序列的效率。【结果】:获得3个人工三锌指蛋白随机库, 每个库约含有2×106个单克隆, 通过2轮细菌双杂交筛选, 分别获得48个针对CFTR基因左右两侧靶位点的三锌指蛋白。ZFN活性验证结果表明, 约90%的ZFN能够在酵母细胞内实现靶向切割, 获得了高效特异的ZFN。【结论】:获得了猪CFTR基因高效特异的ZFN。