中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

编号 zgly0001674822

文献类型 期刊论文

文献题名 中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

作者 车林茸  何正波  韩宝珠  陈晓洁  闫振天  乔梁  陈斌 

作者单位 重庆师范大学生命科学学院媒介昆虫重庆市重点实验室 

母体文献 昆虫学报 

年卷期 2019年05期

年份 2019 

分类号 R384.1  Q78 

关键词 中华按蚊  电转化显微注射  增强型绿色荧光蛋白基因  芳香烷基胺-N-乙酰基转移酶基因  瞬时过表达  基因功能 

文摘内容 【目的】构建在中华按蚊Anopheles sinensis中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDITⅡ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建EGFP和Bm-iAANAT基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测EGFP和Bm-iAANAT的表达。【结果】构建了用于显微注射的PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40和PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40过表达载体。PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体PIZ-modi-EGFP-SV40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的EGFP基因明显高表达。PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体PIZ-modi-AANAT-T2A-EGFP-SV40的阴性对照组和注射过表达载体PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因Bm-iAANAT和EGFP的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。