热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

编号 zgly0001533262

文献类型 期刊论文

文献题名 热脱硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表达、纯化及功能分析

作者 王帅锋  刘娜女  段晓磊  罗亦欣  范三红  奚绪光 

作者单位 西北农林科技大学生命科学学院 

母体文献 西北农林科技大学学报(自然科学版 

年卷期 2016年09期

年份 2016 

分类号 Q936 

关键词 热脱硫弧菌  Pif1解旋酶  蛋白表达纯化  DNA结合活性  DNA解旋活性 

文摘内容 【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌(Thermodesulfovibrio yellowstonii H.)Pif1解旋酶(TyPif1),研究TyPif1解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将Typif1解旋酶编码区和SUMO促溶标签编码区融合连入pET15b获得重组表达载体pET15b-SUMO-TyPif1,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化获得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除标签,再经Ni-NTA柱去除标签蛋白及SUMO蛋白酶,经Heparin柱进一步纯化最终获得TyPif1全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱(CD)和荧光共振能量转移(FRET)分析TyPif1解旋酶的DNA结合活性、解旋活性以及二级结构的热稳定性。【结果】获得了纯度大于95%的TyPif1蛋白,1L培养基可以获得约10mg纯度大于95%的蛋白;TyPif1解旋酶结合单链DNA和G4DNA的活性明显高于双链DNA;TyPif1具有较高的解旋G4DNA的活性,在25~60℃下其二级结构相对稳定,且解旋速率随温度升高而增大,25~50℃TyPif1的解旋速率由0.09s-1增大到0.23s-1。【结论】表达纯化了热脱硫弧菌TyPif1解旋酶,其不仅具有良好的热稳定性,同时具有特异的结合和解旋G4DNA的能力。