一种枯草芽孢杆菌蛋白酶及其制备方法

申请号 CN202310050308.6

专利名称 一种枯草芽孢杆菌蛋白酶及其制备方法

专利类型 发明 

年份 2023 

公开号 CN116622682A

公开日 2023.08.22

主分类号 C12N9/56

分类号 C12N9/56  C12N1/20  A61K38/48  A61P7/02  A23C9/12  A01N63/22  A01P3/00  C12R1/125 

申请日 2023.02.01

申请人 沈阳农业大学 

国家省市 辽宁 

联系地址 110866 辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号

发明人 乌日娜  武俊瑞  张淘崴  娄梦雪  吕加平  张书文  纪帅奇  杨慧  贺凯茹  潘国杨 

代理人 王丹

代理机构 北京识然知识产权代理事务所(普通合伙) 11975

内容摘要 本发明涉及功能微生物应用技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌蛋白酶及其制备方法。所述蛋白酶由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SNBS?3产生，在中性或偏碱性的环境下有良好的稳定性，对单增李斯特菌具有很强的抑制能力，体外溶栓效果和对乳蛋白的溶解效果显著，应用前景广阔。

主权利要求 1.一种由枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶的制备方法包括如下步骤：(1)发酵液制备：将枯草芽孢杆菌接种于10mL液体LB培养基培养过夜，然后转接至LB液体培养基1L中，37℃恒温培养24h成为一级种子；将一级种子接种至LB液体培养基20L中，调节液体培养基的pH至7，37℃恒温培养24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液；(2)蛋白粗酶粉的制备：将枯草芽孢杆菌发酵液在4℃、10000r/min的条件下离心10min，去菌体，得上清液；按5％的体积比向上清液中添加裂解液，在50℃水浴环境下加热5h后震荡重悬，恢复至室温保存4h，10000rpm离心6min后取清液于烧杯至于磁力搅拌器，使用硫酸铵萃取法，向烧杯中缓慢加入硫酸铵至75％浓度，持续搅拌30min后，在4℃冰箱静置12h，继续上述离心操作舍弃上清液，使用Tris-HCl与蒸馏水配置的缓冲液冲洗、捶打、重悬黑褐色沉淀物，采用分子截留量为1万的超滤膜分离，将得到的分离液与有机溶剂乙酸乙酯按1:1的比例进行萃取，乙酸乙酯分成5次倒入分液漏斗中，每次加入乙酸乙酯后轻轻按同一方向摇晃，等待静置分层后取乳化层，倒入干净的三角瓶中，将5次萃取得到的乳化层合并后，用旋转蒸发仪于45℃进行旋转蒸发，直至溶液中没有乙酸乙酯的残留，同时除去样品中多余水分，得到蛋白酶粗提液，冻干成粉末状，得到蛋白粗酶粉；(3)蛋白酶的纯化：将0.5g蛋白粗酶粉溶于4ml 0.01mol/L pH5.7 PBS上样缓冲液中，4℃、8000rpm离心10min后上清上样于经处理平衡的CM-sepharose FF层析柱，并用上样缓冲液洗脱杂蛋白，流速为0.4ml/min；杂蛋白洗脱后，用0.5mol/L NaCl梯度洗脱液进行洗脱，流速为0.5ml/min，每5min收集1管，使用酶标仪于280nm波长处检测OD值，根据OD值将洗脱出来的物质分成各个洗脱峰，并透析，以酪蛋白为指标测定酶活力，收集具有蛋白酶活性的洗脱物质，进行冷冻干燥，获得纯化的蛋白酶。

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